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多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程,固相合成順序一般從C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成。過(guò)去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法。現(xiàn)在多采用固相合成法,從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生,參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是保護(hù)的。羧基端是游離的,并且在反應(yīng)之前必須活化。化學(xué)合成方法有兩種,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢(shì),現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成。

 具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成:

一、去保護(hù):Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。

二、激活和交聯(lián):下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián),形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán):這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。

三、洗脫和脫保護(hù):多肽從柱上洗脫下來(lái),其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑(TFA) 洗脫和脫保護(hù)。

2. 樹脂的選擇及氨基酸的固定

  將固相合成與其他技術(shù)分開來(lái)的最主要的特征是固相載體。能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求:必須包含反應(yīng)位點(diǎn)(或反應(yīng)基團(tuán)),以使肽鏈連在這些位點(diǎn)上,并在以后除去;必須對(duì)合成過(guò)程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定;載體必須允許在不斷增長(zhǎng)的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸;另外,載體必須允許提供足夠的連接點(diǎn),以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽,并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。

   用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類:聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物,這些樹脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán),才能直接連上(第一個(gè))氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同,又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂,如Merrifield樹脂;FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王氏樹脂。氨基酸的固定主要是通過(guò)保護(hù)氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成的共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)的,形成共價(jià)鍵的方法有多種:氯甲基樹脂,通常先制得保護(hù)氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽,然后在適當(dāng)溫度下,直接同樹脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DMF或DMSO中反應(yīng);羧基樹脂,則通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC或羧基二咪唑,使被保護(hù)氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定;氨基樹脂或酰肼型樹脂,卻是加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC后,通過(guò)保護(hù)氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來(lái)完成氨基酸的固定。

3.氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除

  要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽,需要對(duì)暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù),同時(shí)對(duì)氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù),反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣,固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護(hù)基,因?yàn)檫@樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基,由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除,所以后來(lái)改為叔丁氧羰基(BOC)保護(hù),用TFA(三氟乙酸)脫保護(hù),但不適用含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的肽類的合成。1978年,chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報(bào)道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護(hù)基,Fmoc基對(duì)酸很穩(wěn)定,但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去,近年來(lái),Fmoc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法,可通過(guò)皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合;叔丁酯在酸性條件下除去;芐酯常用催化氫化除去。對(duì)于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來(lái)說(shuō),為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來(lái)的副反應(yīng),一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng),又要保證在肽合成過(guò)程中不受破壞,同時(shí)又要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S-,用酸或銀鹽、汞鹽除去;組氨酸的咪唑環(huán)用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護(hù),可通過(guò)催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基(Adoc)保護(hù),用冷的三氟乙酸脫去。固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致,將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵,要形成酰胺鍵,經(jīng)常用的手段是將羧基活化,變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑(如碳二亞氨)形成對(duì)稱酸酐等方法來(lái)形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對(duì)稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基,FMOC法直接用TFA,有時(shí)根據(jù)條件不同,其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。